PCR检测实验步骤
一、基因样本准备
1.细胞或组织采集
根据实验目的，采集相应的细胞或组织样本，如从培养皿中收集细胞或从生物体获取组织。
2.RNA提取
使用Trizol试剂法、试剂盒法等从细胞或组织中提取总RNA，过程包括裂解细胞、分离RNA、沉淀和洗涤RNA等步骤，最后用无RNA酶的水溶解RNA。
3.RNA质量检测
通过琼脂糖凝胶电泳观察RNA条带完整性，使用分光光度计测定RNA在260nm和280nm处的吸光度，计算A260/A280比值评估纯度，比值在1.8-2.0之间表明纯度较好。cDNA合成-反转录反应体系配制：在反应管中依次加入RNA模板、反转录酶、随机引物或Oligo(dT)引物、dNTPs、缓冲液等，总体积一般为20μl。
4.反转录反应条件
通常先在65℃下孵育5分钟使RNA变性，然后在42℃-50℃下进行反转录反应30-60分钟，最后70℃保温10分钟使反转录酶失活，得到cDNA产物。
二、qPCR反应
1.反应体系配制
在qPCR反应管中加入cDNA模板、上下游引物、荧光染料（如SYBR GreenⅠ）或荧光探针、Taq酶、dNTPs、缓冲液等，总体积一般为20μl或25μl。
2.反应程序设置
一般包括95℃预变性30秒-5分钟，使DNA模板充分变性；然后进入循环阶段，如95℃变性10-30秒，55℃-65℃退火10-30秒，72℃延伸10-30秒，循环数通常为35-45次；最后进行熔解曲线分析，一般从65℃缓慢升温到95℃，每隔一定温度（如0.5℃）采集荧光信号。
三、结果分析
1.定性分析
通过观察扩增曲线是否呈S型，判断反应是否正常。若曲线起跳早、斜率大，说明模板量多或扩增效率高；若曲线异常，如无扩增、扩增曲线不光滑等，需分析原因，如引物设计问题、模板质量不佳等。
2.定量分析
根据标准曲线法或ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。标准曲线法需先构建已知浓度的标准品的标准曲线，然后根据样品的Ct值从标准曲线上计算出样品的起始拷贝数；ΔΔCt法需选择内参基因，通过比较目的基因和内参基因的Ct值差异来计算目的基因的相对表达量。
