极个别同学
Western Blot 实验常见问题与解决办法
一、蛋白样品制备
问题1：蛋白提取量低
- 原因：组织或细胞破碎不充分、裂解液配方不合适、样品保存不当导致蛋白降解。
- 解决办法：优化破碎方法（如增加超声时间、使用液氮研磨）；根据样本类型选择合适裂解液（如含蛋白酶抑制剂防止降解）；新鲜制备样品，避免反复冻融。
问题2：蛋白样品中杂质多
- 原因：裂解液成分残留、细胞碎片未充分去除。
- 解决办法：裂解后进行高速离心（12000 rpm以上）；采用过滤或透析方法去除杂质；使用预清洗过的裂解液。
二、SDS-PAGE电泳
问题1：条带扭曲、拖尾
- 原因：凝胶聚合不均匀、样品中含有不溶性颗粒、电压过高。
- 解决办法：确保凝胶试剂新鲜配制，聚合时温度稳定；样品离心后取上清；降低电泳电压，延长电泳时间
问题2：蛋白条带分离效果差
- 原因：凝胶浓度选择错误、电泳缓冲液失效。
- 解决办法：根据蛋白分子量选择合适凝胶浓度（如12%分离胶适合10-100 kDa蛋白）；更换新鲜电泳缓冲液。
三、转膜
问题1：转膜效率低
- 原因：转膜时间或电流不足、转膜缓冲液成分错误、膜与胶贴合不紧密。
- 解决办法：根据蛋白分子量调整转膜条件（大分子蛋白需延长时间或提高电流）；使用含甲醇的缓冲液（但糖蛋白需避免甲醇）；排除气泡，使用转膜夹压实。
问题2：膜上出现白色斑点
- 原因：转膜过程中膜干燥、凝胶与膜之间存在气泡。
- 解决办法：全程保持膜和凝胶湿润；转膜前充分浸泡膜和滤纸，确保无气泡残留。
四、封闭与抗体孵育
问题1：背景信号过高
- 原因：封闭不充分、抗体浓度过高、洗涤不彻底。
- 解决办法：延长封闭时间或更换封闭液（如5%脱脂奶粉或BSA）；优化抗体稀释比例；增加洗涤次数和时间（每次10-15分钟，3-5次）。
问题2：目的条带弱或无条带
- 原因：抗体特异性差、一抗或二抗失活、抗原量不足。
- 解决办法：选择高特异性抗体，使用阳性对照验证；增加上样量或浓缩样品；重新配制抗体，确保孵育温度和时间合适。
五、显色与成像
问题1：条带模糊或拖影
- 原因：曝光时间过长、显影液污染、膜未完全干燥。
- 解决办法：缩短曝光时间，尝试梯度曝光；更换新鲜显影液；确保膜干燥后再扫描。
问题2：化学发光无信号
- 原因：发光底物失效、曝光时间过短、仪器灵敏度不足。
- 解决办法：使用新鲜配制的底物；延长曝光时间或更换高灵敏度成像设备。
一、蛋白样品制备
问题1：蛋白提取量低
- 原因：组织或细胞破碎不充分、裂解液配方不合适、样品保存不当导致蛋白降解。
- 解决办法：优化破碎方法（如增加超声时间、使用液氮研磨）；根据样本类型选择合适裂解液（如含蛋白酶抑制剂防止降解）；新鲜制备样品，避免反复冻融。
问题2：蛋白样品中杂质多
- 原因：裂解液成分残留、细胞碎片未充分去除。
- 解决办法：裂解后进行高速离心（12000 rpm以上）；采用过滤或透析方法去除杂质；使用预清洗过的裂解液。
二、SDS-PAGE电泳
问题1：条带扭曲、拖尾
- 原因：凝胶聚合不均匀、样品中含有不溶性颗粒、电压过高。
- 解决办法：确保凝胶试剂新鲜配制，聚合时温度稳定；样品离心后取上清；降低电泳电压，延长电泳时间
问题2：蛋白条带分离效果差
- 原因：凝胶浓度选择错误、电泳缓冲液失效。
- 解决办法：根据蛋白分子量选择合适凝胶浓度（如12%分离胶适合10-100 kDa蛋白）；更换新鲜电泳缓冲液。
三、转膜
问题1：转膜效率低
- 原因：转膜时间或电流不足、转膜缓冲液成分错误、膜与胶贴合不紧密。
- 解决办法：根据蛋白分子量调整转膜条件（大分子蛋白需延长时间或提高电流）；使用含甲醇的缓冲液（但糖蛋白需避免甲醇）；排除气泡，使用转膜夹压实。
问题2：膜上出现白色斑点
- 原因：转膜过程中膜干燥、凝胶与膜之间存在气泡。
- 解决办法：全程保持膜和凝胶湿润；转膜前充分浸泡膜和滤纸，确保无气泡残留。
四、封闭与抗体孵育
问题1：背景信号过高
- 原因：封闭不充分、抗体浓度过高、洗涤不彻底。
- 解决办法：延长封闭时间或更换封闭液（如5%脱脂奶粉或BSA）；优化抗体稀释比例；增加洗涤次数和时间（每次10-15分钟，3-5次）。
问题2：目的条带弱或无条带
- 原因：抗体特异性差、一抗或二抗失活、抗原量不足。
- 解决办法：选择高特异性抗体，使用阳性对照验证；增加上样量或浓缩样品；重新配制抗体，确保孵育温度和时间合适。
五、显色与成像
问题1：条带模糊或拖影
- 原因：曝光时间过长、显影液污染、膜未完全干燥。
- 解决办法：缩短曝光时间，尝试梯度曝光；更换新鲜显影液；确保膜干燥后再扫描。
问题2：化学发光无信号
- 原因：发光底物失效、曝光时间过短、仪器灵敏度不足。
- 解决办法：使用新鲜配制的底物；延长曝光时间或更换高灵敏度成像设备。
2025-05-16
浏览527
登录后评论
点赞
评论
1