极个别同学
LPS诱导细胞炎症模型建立实验流程
脂多糖（LPS）诱导细胞炎症模型常用于炎症相关的细胞生物学研究。下面以常用的RAW264.7巨噬细胞为例，介绍其实验流程：
实验准备
1. 细胞：RAW264.7巨噬细胞。
2. 试剂：LPS、细胞培养基（如DMEM）、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素双抗、胰蛋白酶、PBS缓冲液、CCK-8试剂、ELISA试剂盒（检测炎症因子，如TNF-α、IL-6等）。
3. 仪器：细胞培养箱、超净工作台、离心机、酶标仪、倒置显微镜。
实验步骤
1. 细胞复苏：从液氮罐中取出RAW264.7细胞冻存管，迅速放入37℃水浴锅中摇晃，使其快速融化。在超净工作台中将细胞悬液转移至离心管，加入5mL含10%FBS的DMEM培养基，1000rpm离心5min，弃上清，再用培养基重悬细胞，接种至培养瓶，置于37℃、5%CO₂培养箱培养。
2. 细胞传代：当细胞密度达到80%-90%时进行传代。弃去旧培养基，用PBS洗涤细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化，在倒置显微镜下观察，待细胞变圆脱落后，加入含10%FBS的培养基终止消化，吹打细胞制成单细胞悬液，按1:3或1:4的比例接种至新培养瓶继续培养。
3. 细胞铺板：取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化后计数，用含10%FBS的DMEM培养基调整细胞密度为5×10⁴-1×10⁵个/mL，接种至96孔板，每孔100μL，放入培养箱孵育过夜，使细胞贴壁。
4. LPS诱导：细胞贴壁后，将培养基更换为无血清或低血清（1%FBS）培养基同步化处理2-4h 。设置对照组（不加LPS，只加等量培养基）和实验组（加入不同浓度LPS，如0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL等 ），每个浓度设置3-5个复孔，继续培养12-24h。
5. 检测指标
- 细胞活力：采用CCK-8法检测。向每孔加入10μL CCK-8试剂，继续孵育1-4h，用酶标仪测定450nm处吸光度值，计算细胞活力。
- 炎症因子分泌：收集细胞培养上清，按照ELISA试剂盒说明书操作，检测TNF-α、IL-6等炎症因子含量。
注意事项
1. 实验全程需严格无菌操作，避免细胞污染。
2. LPS的浓度和诱导时间需预实验优化，以获得最佳炎症模型效果。
3. 细胞铺板时需保证细胞均匀分布，避免出现细胞聚集或密度不均的情况。
脂多糖（LPS）诱导细胞炎症模型常用于炎症相关的细胞生物学研究。下面以常用的RAW264.7巨噬细胞为例，介绍其实验流程：
实验准备
1. 细胞：RAW264.7巨噬细胞。
2. 试剂：LPS、细胞培养基（如DMEM）、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素双抗、胰蛋白酶、PBS缓冲液、CCK-8试剂、ELISA试剂盒（检测炎症因子，如TNF-α、IL-6等）。
3. 仪器：细胞培养箱、超净工作台、离心机、酶标仪、倒置显微镜。
实验步骤
1. 细胞复苏：从液氮罐中取出RAW264.7细胞冻存管，迅速放入37℃水浴锅中摇晃，使其快速融化。在超净工作台中将细胞悬液转移至离心管，加入5mL含10%FBS的DMEM培养基，1000rpm离心5min，弃上清，再用培养基重悬细胞，接种至培养瓶，置于37℃、5%CO₂培养箱培养。
2. 细胞传代：当细胞密度达到80%-90%时进行传代。弃去旧培养基，用PBS洗涤细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化，在倒置显微镜下观察，待细胞变圆脱落后，加入含10%FBS的培养基终止消化，吹打细胞制成单细胞悬液，按1:3或1:4的比例接种至新培养瓶继续培养。
3. 细胞铺板：取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化后计数，用含10%FBS的DMEM培养基调整细胞密度为5×10⁴-1×10⁵个/mL，接种至96孔板，每孔100μL，放入培养箱孵育过夜，使细胞贴壁。
4. LPS诱导：细胞贴壁后，将培养基更换为无血清或低血清（1%FBS）培养基同步化处理2-4h 。设置对照组（不加LPS，只加等量培养基）和实验组（加入不同浓度LPS，如0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL等 ），每个浓度设置3-5个复孔，继续培养12-24h。
5. 检测指标
- 细胞活力：采用CCK-8法检测。向每孔加入10μL CCK-8试剂，继续孵育1-4h，用酶标仪测定450nm处吸光度值，计算细胞活力。
- 炎症因子分泌：收集细胞培养上清，按照ELISA试剂盒说明书操作，检测TNF-α、IL-6等炎症因子含量。
注意事项
1. 实验全程需严格无菌操作，避免细胞污染。
2. LPS的浓度和诱导时间需预实验优化，以获得最佳炎症模型效果。
3. 细胞铺板时需保证细胞均匀分布，避免出现细胞聚集或密度不均的情况。
2025-05-20
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